日前，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴实验室与美国加州大学圣地亚哥分校赵云德教授实验室合作，揭示了Cpf1介导的同源重组修复途径（homology-directed DNA repair, 简称HDR）实现农作物基因替换的修复机制，并在水稻中成功实现乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase, 简称ALS)基因的等位基因替换，获得抗除草剂水稻。相关研究论文在 Journal of Experimental Botany 杂志上于6月28日在线发表。

　　Cpf1蛋白最初发现于2015年，隶属于II类type V CRISPR系统，是比Cas9蛋白更小且更简单的核酸内切酶，具有组装简单、脱靶效率低等优点。不同于CRISPR/Cas9，CRISPR/Cpf1识别富含胸腺嘧啶“TTTV”的PAM序列，因此可实现对基因的5’和3’非翻译区进行编辑。CRISPR/Cpf1系统的发展扩大了基因组编辑技术的应用范围，为植物功能基因组研究和农作物改良提供了强有力的工具。但由于Cpf1的发现较晚和研发时间较短、相关技术体系尚不成熟等，目前还未有利用CRISPR/Cpf1介导的定点同源重组，实现重要农作物农艺性状改良的报道。

　　借助HDR途径实现目的基因替换和基因定点插入，进而创制农作物新种质是基因组编辑研究的重要课题之一。但由于植物细胞内HDR发生频率低，这在很大程度上阻碍了利用CRISPR/Cas系统对农作物基因进行精确编辑。CRISPR/Cpf1产生的DSBs具有5’突出端，其交错切割模式可能促进修复模板与基因组DNA的配对并使之插入基因组中，但其潜在修复机制仍需要进一步探究。本研究结果表明，当同源修复模板存在时，Cpf1产生的DNA双链切口（Double strand breaks, DSBs）经合成依赖性修复方式进行修复。利用此修复机制，我们将水稻中野生型ALS基因通过同源重组，进行等位基因替换，突变后的ALS基因携带有两个突变的氨基酸位点，从而赋予水稻植株除草剂抗性。进一步研究发现，当修复模板中只含有左侧同源臂时，同源替换事件仍可精确发生。此研究结果不仅在很大程度上简化了修复模板的设计，而且能够促进我们更好地理解HDR在植物中发生的潜在机制，进而为利用CRISPR/Cas基因组编辑技术，实现农作物基因的基因替换和定点整合等精准编辑研究提供了依据。

　　作科所博士研究生李少雅为本文第一作者，作科所夏兰琴研究员和华中农大赵云德教授为本文的共同通讯作者。本研究得到国家重点研发计划、转基因专项和中国农科院创新工程资助。

　　下载地址： https://academic.oup.com/jxb/advance-article/doi/10.1093/jxb/ery245/5046212?searchresult=1